Zwariowana opowieść o niezwykłych przygodach Larry'ego (Ben Stiller), strażnika w muzeum historii naturalnej, który odkrywa, że nocą zgromadzone w muzeum eksponaty budzą się do życia. Kiedy tyranozaur z wodzem Hunów Attylą sieją zniszczenie na marmurowych korytarzach, starożytni Rzymianie wypowiadają wojnę Indianom, a lwy i małpy urządzają sobie szalone gonitwy wśród bezcennych dzieł sztuki, Larry zachodzi w głowę, jak opanować narastający chaos. Jego syn Nick (Jake Cherry) nie wierzy początkowo w fantastyczne opowieści ojca. Zmienia jednak zdanie, gdy sam spędza noc w muzeum i przekonuje się, że niezwykły świat, o którym opowiadał mu ojciec, istnieje naprawdę.

Nieudacznik Larry Daley podejmuje pracę nocnego stróża w Muzeum Historii Naturalnej. Już podczas swojego pierwszego dyżuru odkrywa, że za sprawą egipskiego obelisku po zachodzie słońca eksponaty budzą się do życia. Po salach budynku biega olbrzymi szkielet dinozaura, a miniaturowi wojownicy toczą między sobą regularne bitwy. W tej krytycznej sytuacji Larry może liczyć na pomoc samego Theodore'a Roosevelta.

"Noc w muzeum" to parodia filmów grozy. Larry Daley (Ben Stiller) jest strażnikiem, pracującym na nocnej zmianie w Muzeum Historii Naturalnej. Bez przerwy prześladuje go pech, zarówno w pracy, jak i poza nią. Podczas jednego z dyżurów, nasz bohater nieświadomie uwalnia magiczną moc, tkwiącą w jednym ze starożytnych eksponatów. Po czym nagle w muzeum rozpętuje się prawdziwy chaos. Wypchane zwierzęta i figury historycznych postaci ożywają, a namalowane na obrazach sceny bitew przenoszą się do rzeczywistości. Wódz Hunów - Attyla - rozgląda się, jaki kraj by tu podbić, neandertalczycy w poszukiwaniu ognia puszczają z dymem pół sali, a na domiar złego T-Rex rusza na polowanie. Jedyną osobą, która może pomóc biednemu strażnikowi w opanowaniu tego bałaganu, jest były prezydent USA - Teddy Roosevelt (Robin Williams).

Wszystko zaczyna się kiedy Larry (Ben Stiller) musi znaleźć pracę, by jego dawna żona nie odebrała mu praw rodzicielskich do syna. Znajduje ją w "Muzeum Historii Naturalnej". Gdy zapoznaje się ze wszystkimi szczegółami pracy i zostaje sam w muzeum, po zabawie z mikrofonem zasypia. Gdy budzi się zauważa, że szkielet dinozaura zniknął. Słyszy chlupot wody, powoli podchodzi do korytarza z którego wydobywają się te odgłosy, włącza latarkę i upuszcza ją z przerażenia. Dinozaur ożył! Niestety to nie jedyne dziwne zdarzenia. Całe muzeum budzi się do życia, figury z wosku, wypchane zwierzęta i inne eksponaty bawią się na całego gdy Larry umiera ze strachu. Okazuje się że wszystkiemu winna jest tablica sprowadzona pięćdziesiąt lat temu z Egiptu... Czy stróż nocny poradzi sobie z ożywionymi eksponatami i nie zawiedzie po raz setny syna?

Larry Daley (Ben Stiller), rozwiedziony mężczyzna i ojciec Nicka (Jake Cherry), zawsze wierzył, że jest stworzony do rzeczy wielkich. Nie zdawał sobie jednak sprawy, przed jakim wyzwaniem stanie przyjmując mało ambitna posadę ochroniarza w Muzeum Historii Naturalnej. Już pierwszej nocy jest świadkiem niewiarygodnych wydarzeń - zgromadzone w muzeum eksponaty ożywają. Pierwotne bestie i historyczne postaci wzniecają ogromne zamieszanie. Tyranozaur z wodzem Hunów sieją zniszczenie a lwy i małpy biegają między delikatnymi eksponatami. W obliczu groźby utraty pracy Larry musi stoczyć bitwę o ratowanie muzeum. Wreszcie doczekał się chwili, w której będzie mógł udowodnić swoją wielkość.

Larry Daley (Stiller), pechowy marzyciel, którego niestworzone idee nigdy nie zaprocentowały, na gwałt potrzebuje zajęcia. Zrezygnowany, przyjmuje posadę ochroniarza w Muzeum Historii Naturalnej. Już pierwszej nocy przekonuje się, że nie jest to zwykłe miejsce pracy. Kiedy bowiem zapada zmrok - muzeum ożywa. Dosłownie. Staje twarzą w twarz z krwiożerczym szkieletem T-Rexa, armią maleńkich rzymskich żołnierzyków, kowbojami czy złośliwymi małpami.

Larry Daley jest niepoprawnym marzycielem. Wierzy, że jest stworzony do rzeczy wielkich, ale, niestety wciąż nikt nie potrafi go należycie docenić. Nawet jego nastoletni syn uważa go za beznadziejnego ciamajdę.
W celu uzupełnienia szczupłego domowego budżetu, Larry przyjmuje posadę nocnego strażnika w Muzeum Historii Naturalnej.
Ale pech go nie opuszcza. Już pierwszej nocy, gdy zostaje sam w przepastnym muzeum, odnosi wrażenie, ze nie jest w nim sam. Nieświadomie uwolnił starożytne zaklęcie, uwięzione w pewnym eksponacie. Z rosnącym przerażeniem w oczach obserwuje, jak prehistoryczne bestie i figury historycznych postaci wokół niego ożywają i przywrócone do życia wzniecają ogromne zamieszanie.
Kiedy lwy i małpy zaczynają myszkować między eksponatami, a tyranozaur z wodzem Hunów Attylą sieją zniszczenie, Larry, w obliczu groźby utraty pracy i kolejnego zawodu uczynionego synowi, rozpaczliwie próbuje odzyskać kontrolę nad muzeum. O pomoc postanawia zwrócić się do historycznego twardziela, również ożywionego prezydenta Teddy'ego Roosevelta. Człowiek, który zawsze czekał a swoje 5 minut wielkości, wreszcie sie doczekał.