James Best urodził się 26 lipca 1926 roku jako Jules Guy w Powderly, w stanie Kentucky. Wcześnie osierocony, został adoptowany przez Armena i Essę Bestów i przeprowadził do Corydon, w stanie Indiana. Po ukończeniu szkoły średniej pracował krótko w przemyśle metalowym, by w 1945 roku, tuż po II wojnie światowej, wstąpić do armii. Grał w ponad osiemdziesięciu filmach (między innymi "Zakazana planeta", "Samotny jeździec", "Kaskaderzy", "Hot Tamale" i "Skok po marzenia"), jednak największą sławę przyniosła mu rola szeryfa Roscoe P. Coltrane'a w serialu "The Dukes of Hazzard". W latach 70. i 80. uczył aktorstwa na uniwersytetach Mississippi i Central Florida. Dwukrotnie żonaty: w latach 1959-1977 z Jobee Ayers, od 1986 roku z Dorothy Best. Jest ojcem Janeen Damian.