Ezio to legendarny Mistrz Zakonu Asasynów, który prowadzi długą walkę z potężnym zakonem Templariuszy. Tym razem bohater udaje się do Rzymu, centrum władzy, chciwości i korupcji. Pokonanie skorumpowanych tyranów nie będzie proste. Ezio będzie musiał wykazać się nie tylko siłą, ale także umiejętnościami przywódczymi. Gracz wcielający się w jego postać obejmie także kontrolę nad zakonem zabójców. Tylko współpracując razem z nimi Asasyn ma szansę pokonać śmiertelnego wroga.

Po pokonaniu Rodrigo Borgii, inicjatora spisku wymierzonego w rodzinę Auditore, Ezio wraz ze swoim wujem wraca do Monterriggioni, czując, że zakończył już wendettę za śmierć jego ojca i braci. Sielanka nie trwa jednak długo - syn papieża, Cesare Borgia wraz ze swoimi ludźmi napada na Monteriggioni i odbiera asasynom Rajskie Jabłko - potężny artefakt, którego użytkownik może narzucać innym ludziom swoją wolę. W obronie miasta ginie Mario. Ezio zostaje zaś poważnie ranny. Gdy odzyskuje siły, postanawia podążyć śladami wroga i ponownie wyruszyć do Rzymu.